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Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 604 (2023) Citare questo articolo

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La terapia con cellule CAR T è un’area di trattamenti oncologici in rapida crescita che ha il potenziale di diventare una cura standard per molteplici indicazioni. Per coincidenza, la tecnologia di modifica genetica CRISPR/Cas sta entrando nella produzione di prodotti a base di cellule CAR T di prossima generazione con la promessa di una metodologia di modifica cellulare più precisa e più controllabile. L’intersezione di questi progressi medici e molecolari crea un’opportunità per modi completamente nuovi di progettare cellule ingegnerizzate per aiutare a superare gli attuali limiti della terapia cellulare. In questo manoscritto presentiamo i dati di prova per un ciclo di feedback ingegnerizzato. Abbiamo prodotto cellule T CAR T inducibili dall'attivazione con l'aiuto dell'integrazione mirata mediata da CRISPR. Questo nuovo tipo di cellule T ingegnerizzate esprime il gene CAR in base al loro stato di attivazione. Questo artificio apre nuove possibilità per regolare la funzione delle cellule CAR T sia in vitro che in vivo. Riteniamo che un tale sistema di controllo fisiologico possa essere una potente aggiunta alla cassetta degli attrezzi attualmente disponibile di costrutti CAR di prossima generazione.

Le cellule T geneticamente modificate che esprimono il recettore delle cellule T modificato (TCR) o il recettore dell'antigene chimerico (CAR) sono potenti strumenti per trattare le neoplasie tumorali1. Fino ad oggi, diverse terapie con cellule CAR T contro i disturbi ematologici sono state approvate e numerose altre sono in fase di valutazione negli studi clinici2. Tutti gli attuali prodotti commerciali utilizzano il rilascio genico basato su vettori virali3. Sebbene si tratti di una strategia consolidata e relativamente sicura, presenta alcune limitazioni significative. Meccanicamente, i vettori virali contemporanei si basano sull’integrazione semi-casuale incontrollata. Sebbene la sicurezza dei vettori virali sia dimostrata dal numero crescente di pazienti trattati con prodotti a base di cellule CAR T e la sicurezza del rilascio di geni virali sia stata accettata dalle agenzie sanitarie, il rischio intrinseco di mutagenesi inserzionale rimane un problema irrisolto4,5,6. Pertanto, la produzione di cellule T di prossima generazione mira a utilizzare metodi di editing genetico meglio controllati come CRISPR/Cas. CRISPR/Cas consente un'integrazione genetica mirata e precisa in posizioni predefinite all'interno del genoma7. Ciò a sua volta non solo rende la procedura di editing più precisa, ma apre anche l'opportunità di sfruttare il sito di integrazione genetica.

Ad oggi tutte le cassette genetiche CAR utilizzate clinicamente sono guidate da promotori artificiali forti e costitutivamente attivi, che sovrascrivono la regolazione trascrizionale dinamica che si verifica in un contesto fisiologico con un impatto diretto sulla cinetica di attivazione, sul fenotipo e sulla sopravvivenza8. L'espressione continua del CAR può portare all'esaurimento e alla funzionalità non ottimale del CAR in vivo9. La tecnologia CRISPR/Cas consente il trasferimento genico a valle di qualsiasi promotore endogeno, riducendo così la necessità di promotori ingegnerizzati o esterni e concentrandosi su modifiche cellulari più fisiologiche8,10. Le regioni promotrici native consentono la trascrizione genica altamente regolata. I complessi modelli di sequenza incanalano segnali regolatori provenienti da potenziatori distali e le proteine ​​modulanti associate portano a una trascrizione distinta11. Preservare la sofisticata regolazione genetica fisiologica può aiutare a progettare prodotti cellulari differenziati. È stato dimostrato che un migliore targeting dei CAR e dei TCR ingegnerizzati apporta chiari benefici alla potenza e alla funzione delle cellule T modificate inserendo geni artificiali sotto il controllo di promotori TCR endogeni fornendo così un'espressione genica (trans-) più fisiologica12.

Inoltre, una strategia di editing ben progettata può migliorare la precisione dell’uccisione mediata dalla CAR. Le cellule CAR T sono molto potenti nella lisi delle cellule che esprimono l'antigene bersaglio (ad esempio, CD7, CD19 o BCMA), ma non distinguono tra cellule sane e anormali13,14,15. Pertanto, dopo aver eseguito il loro compito iniziale di eliminazione del tumore, le cellule T CAR continuano ad attaccare tutte le cellule che esprimono il loro antigene affine16. Sono stati proposti diversi approcci per aggirare questi effetti collaterali off-tumorali sul bersaglio delle cellule T CAR persistenti. Ad esempio, le cellule CAR T possono essere eradicate dopo la completa eliminazione del tumore mediante somministrazione sistemica di anticorpi diretti contro un "kill switch" sintetico co-espresso sulle cellule CAR T, portando al recupero completo e persistente delle cellule B17. Un'altra opzione è l'espressione transitoria del CAR basata sull'mRNA, che reindirizza le cellule T contro le cellule bersaglio solo finché l'mRNA viene fornito sistemicamente18,19. Tuttavia, tali approcci presentano sfide nell’affrontare la cinetica di distribuzione, la precisione, la penetranza e la persistenza delle molecole applicate.